mRNA體外合成質控要點
自新冠疫情爆發(fā)以來，疫苗研發(fā)一直是醫(yī)藥界密切關注的對象。到目前為止，被批準進入臨床試驗的疫苗類型主要包括：滅活疫苗、核酸疫苗、載體疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和減毒活疫苗。而核酸疫苗中的mRNA疫苗憑借其獨特的優(yōu)勢，迅速在疫苗研發(fā)領域占據(jù)一席之地。
mRNA疫苗的優(yōu)勢：
· 導入細胞后表達相應的抗原蛋白，無需體外蛋白表達、純化過程。
· 刺激機體免疫系統(tǒng)產生免疫應答。
· 遞送系統(tǒng)具有類似佐劑的部分特性，可增強機體的免疫反應。
· 通過細胞正常代謝完成mRNA的降解，安全性更高。
mRNA疫苗在多種傳染病（流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒）的臨床研究中已經取得一定的研究進展，但依然存在一些問題，如mRNA本身具有的潛在免疫原性、遞送系統(tǒng)的穩(wěn)定性、納米劑型安全性及所使用陽離子聚合物/脂質體安全性等。此外，雖然mRNA疫苗生產規(guī)模相對簡單，但通常采用的是較為復雜的制劑系統(tǒng)，其藥學研發(fā)和生產控制也更加復雜，因此從疫苗的有效性、安全性和質量可控性考慮，mRNA疫苗的質量控制就顯得格外重要。
在2020年公布的《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術指導原則（試行）》中，對mRNA疫苗生產過程中的質量標準做出了明確要求。mRNA的體外合成的生產工藝包括DNA轉錄模板制備、mRNA原液制備、制劑中間產物檢測和成品檢測。
DNA轉錄模板的制備
通常是利用大腸桿菌來擴增目的基因，隨后進行質粒純化和模板線性化。此階段關鍵的質控項目包括DNA模板濃度/含量、測序、純度、雜質殘留、微生物限度、內毒素等。其中，轉錄模板中的雜質殘留可能包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白殘留等，這些殘留會顯著影響體外轉錄的效率，因此需要對模板純度進行嚴格的質控。
mRNA原液制備
通常采用轉錄模板進行mRNA體外轉錄、mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶處理、mRNA純化等步驟獲得mRNA原液。mRNA修飾（如修飾核苷的加入）、加Poly(A)尾通常在轉錄過程中進行；加帽可在轉錄過程中同時進行，也可作為單獨的工藝步驟。此階段關鍵的質控項目包括：加帽率、加Poly(A)尾產物長度、mRNA序列完整性、序列準確性、純度、mRNA濃度、產品相關雜質（不完整mRNA、截短RNA等）、工藝相關雜質（殘留蛋白、殘留DNA）、無菌、內毒素等。
制劑中間產物檢測
mRNA的非病毒遞送系統(tǒng)主要包括但不限于基于脂質的遞送系統(tǒng)（如核酸脂質復合物（lipoplexes）和陽離子脂質體等）、基于聚合物的載送系統(tǒng)（如polyplexes等）、基于脂質和聚合物的載體系統(tǒng)（如lipopolyplexex等）。mRNA包封/裝載的過程一般系以聚陽離子材料或正電荷脂質等材料與mRNA復合后直接成粒，或成粒后再經包覆形成核殼形結構的過程。制劑制備過程還包括后續(xù)純化步驟，以去除未包封/裝載的mRNA、游離的聚合物或脂質材料和/或包封過程中引入的有害物質?；趍RNA遞送系統(tǒng)制備工藝的實際情況，對制劑中間產物進行質控檢測，關鍵的質控項目包括納米顆粒大小及分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位、正電荷材料相關雜質、不飽和脂質的氧化及相關降解產物、納米顆粒聚集產生的顆粒物、未組裝的脂質分子、陽離子物質、未包封的mRNA等。
成品檢測
除了上述檢測項目之外，mRNA疫苗還應進行體內或體外生物學活性檢測。研發(fā)早期階段建議根據(jù)質量研究部分選擇適宜的方法建立體內效力質控檢測；必要時，根據(jù)產品的作用機理建立細胞免疫檢測活性的質控檢測。
mRNA體外合成質控要點總結
疫情當前，國內外許多企業(yè)和機構大量投入研發(fā)，建立mRNA疫苗新型研發(fā)平臺。作為國產生物試劑優(yōu)質供應商，全式金為這些企業(yè)提供一系列相關產品，助力mRNA疫苗研發(fā)。
1. TransStart? FastPfu Fly DNA Polymerase (AP231)
一種用于快速PCR的熱啟動超高保真DNA聚合酶，該酶擴增速度更快 (6 kb/min)，擴增效率更高，產量更高，保真性更高，靈敏度更高。
· 保真性是EasyTaq? DNA Polymerase的108倍。
· 擴增產物為平端，可直接克隆于pEASY?-Blunt 系列載體中。
· 基因組DNA 片段的擴增 (≤ 15 kb)。
· Plasmid DNA片段擴增 (≤ 20 kb)。
2. EasyPure? HiPure Plasmid MaxiPrep Kit (EM121)
利用硅膠膜離心柱特異地吸附DNA，適用于從≤500 ml LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸桿菌中高效地提取質粒DNA，操作簡單，提取速度快，DNA純度高。提取的質粒DNA適用于酶切、連接、轉化、測序等實驗。
FlyCut? 系列5分鐘快速內切酶，配有通用的專利性配方的特殊緩沖液，具有省時、高效（酶切效率高，無星號活性）的特點。
4. Phi29 DNA Polymerase (LP101)
由重組φ29 DNA polymerase 基因的載體，在大腸桿菌中經誘導表達、純化而成, 分子量為74.4 kDa。具有高保真、高效率、高靈敏度、高產量的特點，用于測序、SNP基因分型、STR/微衛(wèi)星分析、病毒檢測和miRNA檢測。
5. MagicPure? Size Selection DNA Beads (EC401)
基于Solid Phase Reverse Immobilization (SPRI) 原理，采用具有獨特分離作用的磁珠與緩沖液系統(tǒng)，適用于DNA純化、DNA濃縮、高通量測序文庫構建中DNA片段分選，使用方法可與主流文庫構建試劑盒兼容。
6. DNA文庫構建（轉座酶法/傳統(tǒng)DNA建庫法）
★TransNGS? Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina? (for 50 ng/5 ng/1 ng DNA) (KP101/KP121/KP111)
★TransNGS? DNA Library Prep Kit for Illumina? (KP201)
7. RNA文庫構建
★TransNGS? RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina? (KP601)
★TransNGS? Fast RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina? (KP701)
mRNA原液制備
1. T7 High Efficiency Transcription Kit (JT101)
利用T7 RNA Polymerase，以含有T7啟動子的超螺旋質粒DNA或線性DNA為模板，對T7啟動子下游的DNA序列進行高效轉錄。適用于制備長度超過6000 nt的高濃度RNA，制備的RNA可用于體外翻譯、RNase保護實驗、RNA剪切以及雜交探針標記等。全式金T7 RNA聚合酶轉錄試劑盒在每20 μl體系中，1 μg模板可以生成150-280 μg的RNA。
本產品包含牛痘病毒加帽酶、mRNA帽結構2’-O-甲基轉移酶和其他加帽反應組分，可用于對T7體外轉錄(JT101)產生的RNA進行5’加帽修飾，具有高效、高靈活性、操作簡便等特點。反應產物為Cap1-mRNA，加帽效率可接近100%，并且帽子結構方向正確，對于mRNA的穩(wěn)定、轉運（出核）、翻譯過程均有重要作用。
3. mRNA Poly(A) Tailing Kit (LA201)
本產品反應時不依賴模板的存在，催化ATP轉化為AMP并依次摻入到RNA的3’末端，即在mRNA的3’末端加Poly(A) 尾，提高RNA在細胞中的穩(wěn)定性。本產品具有很高的加尾效率，且可平行放大體系用于在體外轉錄(JT101)及加帽后(LC101) mRNA的加尾修飾，制備可用于細胞轉染的RNA樣品。具有高效率、高靈活性、操作簡便等特點。
4. MagicPure? mRNA Kit (EC511)
偶聯(lián)了Oligo (dT)的磁珠與帶Poly(A)尾的mRNA特異結合，純化后的mRNA純度高，完整性好，得到的mRNA適用于RT-PCR、qRT-PCR、二代測序等。本試劑盒適用于磁棒式高通量核酸提取儀。
5. EasyPure? RNA Purification Kit (ER701)
利用硅膠膜離心柱特異地吸附RNA，純化經DNase I處理的總RNA產物、體外轉錄產物、RNA標記產物、合成RNA等，能有效地去除蛋白質、有機化合物、無機鹽離子等雜質，操作簡便、快速。
6. MagicPure? RNA Beads (EC501)
利用獨特的磁珠與緩沖液系統(tǒng)，特異地吸附RNA，純化去除rRNA的RNA產物，經DNase I處理的RNA產物，純化體外轉錄產物、RNA標記產物和合成RNA等。操作簡便、快速。
自動核酸提取儀
TS-32/96自動核酸提取儀是采用先進磁珠分離技術的高科技產品，具有自動化程度高，提取速度快，結果穩(wěn)定，操作簡便的優(yōu)點。全式金作為國內知名的核酸分離純化技術公司，可提供多種配套提取試劑盒，使儀器的使用范圍最大化，成本低廉化。
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參考文獻
[1] 新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術指導原則（試行）
